Mapowanie peptydów w celu identyfikacji struktur białkowych

Metoda ta identyfikuje integralność i dokładność struktury pierwszorzędowej białka za pomocą odpowiednich metod analitycznych po rozszczepieniu białka proteazami lub chemikaliami.

Pierwsza metoda: liza trypsyny - wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami

Oznaczono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

Warunki chromatograficzne: żel krzemionkowy związany oktylosilanem lub żel krzemionkowy związany oktadecylosilanem jako wypełniacz do analizy białek i peptydów: 0,1% kwas trifluorooctowy w fazie ruchomej jako faza ruchoma A w 0,1% kwasie trifluorooctowym w acetonitrylu Roztwór był fazą ruchomą B, przepływ szybkość wynosiła 1 ml na minutę, a gradient eluowano przez 70 minut (od 100% do 30% dla roztworu A i od 0 do 70% dla roztworu B).

Temperatura kolumny: 30 °C ± 5 °C,

Temperatura przechowywania i przechowywania próbki testowej: 2~ 8 °C,

Długość fali detekcji: 214nm,

Metoda badania: weź roztwór badany i roztwór odniesienia (cały roztwór 1 mg na 1 ml, jeśli stężenie próbki badanej i odniesienia jest niewystarczające, należy je zatężyć do odpowiedniego stężenia), używając 1% roztworu wodorowęglanu amonu Pełna dializa, dodać 1:50 (mg/mg) do roztworu trypsyny, aby pobrać trypsynę [traktowaną toluenosulfonyloalanyloketonem (lub czystą analizą sekwencji), dodać 1% roztwór wodorowęglanu amonu do rozpuszczenia Do roztworu zawierającego 0,1 mg na 1 ml] do roztwór badany i roztwór odniesienia, po inkubacji w 37 °C przez 16 do 24 godzin, dodać 50% roztwór kwasu octowego w stosunku 1:10 i wirować przy 10 000 obr./min przez 5 minut.(Lub przefiltrowany przez filtr 0,45 μm), dokładnie pobrać 100 μl supernatantu, wstrzyknąć do chromatografu cieczowego, eluować gradientowo i zapisać chromatogram.Mapa rozwiązania testowego jest porównywana z mapą rozwiązania referencyjnego.

Druga metoda: liza bromocyjanu

Sposób badania: Pobrać odpowiednią ilość próbki badanej i substancji odniesienia (ok. 50 μg białka), dializować z wodą przez 16 godzin, liofilizować, dodać lizat bromocyjanu [odważyć bromocyjan 0,3g, dodać kwas mrówkowy (70% - 100 %) 1 ml rozpuszczono w 20 μl, pozostawiono w temperaturze pokojowej na 24 godziny, a do lizatu dodano wodę (180 μl), po czym przeprowadzono liofilizację.Liofilizowany lizat jest rekonstytuowany wodą do odpowiedniego stężenia.Elektroforezę prowadzono metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (20% żelatynizacja) i barwiono srebrem.Porównaj próbkę testową z mapą odniesienia.